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#author("2020-06-15T10:35:45+09:00","default:edit2015","edit2015") #author("2020-06-16T20:57:51+09:00","default:edit2015","edit2015") *ゲル移動度シフト法[gel mobility shift assay] [#o898ba10] DNA結合タンパク質のDNA結合活性を測定する方法の一つ．ゲルシフト法またはEMSA (electrophoreticmobility shift assay)法とも呼ばれる．基本的には，プローブとなる標識DNA断片をDNA結合タンパク質を含む試料と混合し，ゲル電気泳動を行う．電気泳動の際には， DNAとタンパク質の複合体が解離しないよう，非変性条件はもちろんのこと，塩濃度， pH，温度などを適正に保つことが重要である．ふつう遊離のプローブDNAが速く移動し，タンパク質と結合したプローブDNAの移動度は低くなるので，遅れて移動するバンドを検出し，複合体形成の指標とする．&br; 検出方法は標識の方法により異なる．32Pなどで放射標識したグローブを用いた場合には，ゲルをそのままあるいは乾燥後，オートラジオグラフィーにより検出する．また， DIG (digoxygenin)などでラベルされたブローブを用いた場合には，泳動後にDNAをナイロンなどのフィルター膜に転写し，アルカリホスファターゼなどで標識した抗体を結合させ，最終的には，化学発光基質の分解による化学発光をX線フィルムに記録する．この方法は，精製していないDNA結合タンパク質にも適用できるため， DNA結合タンパク質を検出する最初の段階の実験でも利用できる．また， DNA結合タンパク質を精製する過程でのモニタリングにも利用される．さらに，既知の異なる濃度のプローブDNAのシリーズを用いてゲル移動度シフト実験を行い，プローブ濃度に対する複合体形成量をプロットすることにより， DNA結合タンパク質とプローブDNAとの解離定数を推定することができる．1対1で結合する場合，遊離プローブと結合プローブが等量となるプローブ濃度が解離定数を表す．さらに，プローブDNAとわずかに配列の異なる非標識DNAを共存させることにより，競合実験ができ，結合における配列特異性の評価ができる．結合認識配列は数塩基対であっても，結合実験で実際に使うプローブの長さは通常数十塩基対必要であることが多いが，このような場合であっても，認識配列部分を改変した競合分子を用いることにより，結合の特異性を調べることができる． DNA結合タンパク質のDNA結合活性を測定する方法の一つ．ゲルシフト法またはEMSA (electrophoreticmobility shift assay)法とも呼ばれる．基本的には，プローブとなる標識DNA断片をDNA結合タンパク質を含む試料と混合し，ゲル電気泳動を行う．電気泳動の際には， DNAとタンパク質の複合体が解離しないよう，非変性条件はもちろんのこと，塩濃度， pH，温度などを適正に保つことが重要である．ふつう遊離のプローブDNAが速く移動し，タンパク質と結合したプローブDNAの移動度は低くなるので，遅れて移動するバンドを検出し，複合体形成の指標とする．&br; 検出方法は標識の方法により異なる．&supsc(32);Pなどで放射標識したグローブを用いた場合には，ゲルをそのままあるいは乾燥後，オートラジオグラフィーにより検出する．また， DIG (digoxygenin)などでラベルされたブローブを用いた場合には，泳動後にDNAをナイロンなどのフィルター膜に転写し，アルカリホスファターゼなどで標識した抗体を結合させ，最終的には，化学発光基質の分解による化学発光をX線フィルムに記録する．この方法は，精製していないDNA結合タンパク質にも適用できるため， DNA結合タンパク質を検出する最初の段階の実験でも利用できる．また， DNA結合タンパク質を精製する過程でのモニタリングにも利用される．さらに，既知の異なる濃度のプローブDNAのシリーズを用いてゲル移動度シフト実験を行い，プローブ濃度に対する複合体形成量をプロットすることにより， DNA結合タンパク質とプローブDNAとの解離定数を推定することができる．1対1で結合する場合，遊離プローブと結合プローブが等量となるプローブ濃度が解離定数を表す．さらに，プローブDNAとわずかに配列の異なる非標識DNAを共存させることにより，競合実験ができ，結合における配列特異性の評価ができる．結合認識配列は数塩基対であっても，結合実験で実際に使うプローブの長さは通常数十塩基対必要であることが多いが，このような場合であっても，認識配列部分を改変した競合分子を用いることにより，結合の特異性を調べることができる．
